蛋白质泛素化（ubiquitination）是细胞调控中极为重要的一类翻译后修饰，通过共价连接一个或多个泛素（ubiquitin）分子，调控蛋白的降解、亚细胞定位、DNA修复与信号转导等生命过程。近年来，随着质谱和生物信息学的进步，蛋白质泛素化的研究已从靶向小规模实验扩展到大规模泛素化蛋白质组学。本文聚焦“蛋白质泛素化：体外实验、位点识别与泛素化蛋白质组学”三大主题，从体外体系重建、赖氨酸位点识别技术到泛素链结构与蛋白质组水平的系统研究出发，详解常用的实验策略和技术难点，旨在为研究者提供前沿视角与实践指导。

一、体外泛素化实验体系（In Vitro Ubiquitination Assays）

1、免疫沉淀与泛素化检测 | IP‑WB 与 IP‑SILAC

（1）方法概述：将待测蛋白在细胞裂解液中与特异性抗体或标签（如His、FLAG）共沉淀，检测其是否被泛素化。可使用抗泛素抗体（如FK2）直接检测泛素链，或通过SILAC标记结合质谱识别具体位点。

（2）优缺点：简单直观，适合验证候选蛋白；但无法提供修饰链类型与结构信息，也难以实现绝对定量。

2、原位／体外重组体系 | E1‑E2‑E3 重组体系

（1）体系搭建：体外重组E1（UBA1）、E2和E3与泛素以及ATP混合，可重构泛素成为目标蛋白的反应条件。在纯化体系中能清晰定义催化步骤。

（2）应用方向：适用于筛选潜在E3连接酶、评估底物特异性及泛素链类型分析（如K48、K63链接）。

（3）挑战事项：需重组纯化多个活性蛋白，反应体系复杂，对于多亚基E3酶体系尤为棘手。

3、端粒化修饰捕获 | Ubiquitin Remnant Profiling

（1）原理：泛素化后，剧烈酶切（如胰蛋白酶）将泛素拆解，残留“GG”二肽连接在靶赖氨酸上。通过富集GG修饰肽并进行LC‑MS/MS分析，即可鉴定泛素化位点。

（2）优势：高灵敏度、适用于全蛋白组覆盖，可定量多种样本中泛素化程度差异。

（3）注意事项：需优化富集抗体（anti-K-ε-GG），严格控制背景噪声。

二、位点识别（Site Identification）

1、LC‑MS/MS 定性鉴定

通过串联质谱对富集肽段进行碎片分析，以GG残留特征离子定位赖氨酸泛素化位点。（2）数据库搜索（如Mascot, MaxQuant）中需指定可变修饰为“GG（K）”。

2、定量与差异分析

标签定量（SILAC/iTRAQ/TMT）：在处理组和对照组中通过同位素或化学标签进行量化，揭示差异泛素化位点。（2）无标记标量法（LFQ）：依托强度归一化比较各样本中肽段丰度，适用于样本量较大的研究。

3、泛素链结构与成簇修饰分析

聚焦多聚泛素链的类型（K48 vs K63）及其异构结构。（2）应用如侧链截留、酶解特性分析（例如DUB酶）配合质谱，可推测泛素链拓扑结构。

三、泛素化蛋白质组学技术（Ubiquitinomics）

1、多级富集策略

利用TUBE（Tandem Ubiquitin-Binding Entities）与anti-GG双重富集，提高泛素化蛋白识别率。

2、数据处理与生信解析

通过质谱分析平台（例如Orbitrap Fusion Lumos）获取高质量原始数据。（2）使用专业软件（MaxQuant、Proteome Discoverer）进行谱图解析与GG位点定性。（3）后续生物信息分析，如泛素化位点在蛋白功能域中的分布、代谢通路富集（KEGG/GO）、蛋白–蛋白相互作用建模（STRING），揭示泛素化网络调控机制。

3、泛素化组学在新药标靶发现中的应用

通过比较肿瘤 vs 正常组、药物处理 vs 对照组样本中泛素化水平变化，将高差异位点作为潜在疗法靶点。（2）与蛋白降解药物（PROTACs）或E3抑制剂研发结合，加速靶向泛素化通路的新药开发。

四、研究设计建议与策略优化

1、实验设计与对照设置

至少包含生理样本与处理组、正负对照、技术重复与生物重复（2）若研究药物作用，需纳入剂量梯度与时间梯度设计

2、样本处理与酶切调控

细晶研磨+高效抑制剂体系（如MG132）收获细胞/组织，可增强泛素蛋白体积（2）胰蛋白酶后BBNJ处理短肽产物监控GG残留位点

3、质谱参数预设

采用高能碰撞解离 HCD 模式进行高质量MS2采集（2）用于鉴定位点推荐设置动态范围MS1宽带，分辨率≥120 000

4、数据校正与验证

初步结果需用IP–Western验证关键泛素化蛋白和位点（2）亦可辅以E3敲除/过表达或CRISPR构建位点突变的细胞系，验证功能意义

蛋白质泛素化研究正迈向高通量、系统化的新阶段。无论是体外纯化评估E3底物识别，还是全蛋白组定量研究泛素化动态变化，质谱仍是关键探索工具，富集技术与生信分析能力决定项目质量与创新性。通过融合严谨实验设计、先进平台能力与深度数据解析，科研人员可洞察细胞调控机制，构建功能连接网络，并最终应用于靶向泛素系统的新药物开发。在这一执着融合力量中，百泰派克生物科技通过其装备先进的平台、专专技术与全链条服务，正成为泛素化科研攻坚中的可靠合作伙伴。如果您计划开展泛素化组学项目，欢迎联系百泰派克生物科技的专业团队，我们将为您提供从方案设计、实验执行到成果解读的全程支持。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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